Pages

MITOS 7 TURUNAN HUBUNGANNYA DENGAN GENETIKA

Ada banyak mitos yang berkembang di masyarakat, apakah mitos ini sesuai dapat di jelaskan secara ilmiah?

ACTIVITY IN FORKOM MATABUKA

This moment is very fun .

SAUGI ISLAND

C'mon come to Saugi Island

Lomba Cinta Laut

I made this with my friends in Senior High School 2 Pangkajene

Dange

This food is originally from Pangkep, South Sulawesi

Monday, July 31, 2017

PERANAN BIOETIK DALAM PENGEMBANGAN REKAYASA GENETIKA MANUSIA SEHUBUNGAN DENGAN PERDEBATAN MENGENAI ISU MORAL DAN ETIKA

PENDAHULUAN
            Rekayasa genetika merupakan manipulasi materi genetik yang dilakukan untuk memperoleh organisme unggul ataupun demi kepentingan manusia. Saat ini rekayasa genetika telah berkembang sangat pesat hingga hampir semua aspek dalam kehidupan ini direkayasa mulai dari makanan, minuman, hingga kapas yang digunakan juga merupakan produk rekayasa genetika dan masih banyak lagi. Pada umumnya penerapan aplikasi rekayasa genetika yang melibatkan organisme hewan dan tumbuhan mengalami pengembangan yang sangat pesat karena penelitian tentang hal tersebut terus menerus dilakukan tanpa adanya hambatan berupa isu moral dan etika namun berbeda halnya jika yang menjadi objek penelitian rekayasa genetika adalah manusia itu sendiri, hal ini akan menjadi lebih rumit karena akan bersinggungan dengan berbagai aspek baik moral maupun etika. Walaupun demikian sikap skeptis para peneliti, kemajuan teknologi, keinginan untuk mengatasi masalah disekitarnya membuat rekayasa genetika dengan objek kajian manusia itu sendiri menjadi berkembang beberapa waktu terakhir ini.
            Saat ini pengembangan rekayasa genetika manusia telah berada di fase dimana akan diciptakannya manusia hasil rekayasa genetik. Dalam sebuah pemberitaan Nature yang ditulis oleh Reardon pada 28 September 2016 bahwa ‘seorang bayi laki-laki telah lahir dengan menggunakan teknik kontroversial dengan menggabungkan DNA dari tiga orang melalui teknik penggantian DNA mitokondria’ (Reardon, 2016a) dan pada 13 Oktober, peneliti dari Ukraina juga mengumumkan adanya dua orang wanita yang saat ini telah mengandung fetus yang dibuat dengan menggabungkan DNA dari tiga orang (Reardon, 2016b). Selain hal tersebut, sebelumnya pada tahun 2015 sendiri telah banyak perdebatan utamanya dalam hal rekayasa genetik untuk menciptakan bayi yang sempurna melalui teknologi editing gen yang disebut CRISPR dan teknik ini mulai dikembangkan dengan menggunakan embrio manusia sejak awal Februari 2016 oleh Francis Crick Institute UK (Regalado, 2015; Schultz, 2016). Walaupun telah banyak penelitian utamanya dalam menciptakan manusia hasil rekayasa genetik namun hingga saat ini, hal ini masih terus diperdebatkan di kalangan sainstis itu sendiri terkait masalah etik sehingga di beberapa negara penerapan teknik yang serupa masih dilarang.
            Pada makalah ini akan dibahas lebih lanjut mengenai peranan bioetik dalam pengembangan rekayasa genetika manusia yang mengarah pada penciptaan manusia hasil rekayasa genetika sehubungan dengan perdebatan mengenai isu moral dan etika.

KAJIAN PUSTAKA
            Gen merupakan unit pembawa informasi, beberapa penyakit disebabkan oleh gen utamanya yang meyangkut penyakit herediter (Simmon, 2008) salah satunya penyakit yang disebabkan mutasi pada DNA mitokondria (mtDNA). Mutasi pada mtDNA menyebabkan terjadinya abnormalitas utamanya menyangkut metabolisme, hal ini karena sebagian besar protein yang terlibat dalam proses metabolisme dikode oleh gen yang berasal dari mitokondria itu sendiri. Abnormalitas yang terjadi ini akan mengarahkan pada malfungsi tubuh yang meningkatkan terjadinya resiko terjangkit penyakit lainnya seperti diabetes, penyakit hati, melemahnya otot, dan beberapa masalah system saraf. Karena berhubungan dengan DNA yang terletak pada mitokonria sehingga proses pewarisannya secara maternal, karena yang menyumbangkan mitokondria hanyalah sel telur. Walaupun demikian, seseorang dengan resiko tersebut masih dapat memiliki anak yang normal karena terjadinya segregasi selama proses oogenesis sehingga ada kemungkinan sel telur yang dihasilkan memiliki mitokondria yang sehat sehingga bergantung lagi pada tingkat resiko yang ada (Taylor & Turnbull, 2005; CRG, 2015).
            Saat ini sebanyak 1 dari 10.000 orang mengidap penyakit mitokondria dan sebanyak 1 dari 200 diantaranya adalah carrier. Belum ada obat yang diketahui dapat mengobati penyakit mitokondria, apabila seorang wanita diketahui mengalami penyakit ini maka secara otomatis dia juga akan mewariskan hal tersebut kepada anak-anaknya sehingga hanya ada dua cara yang dapat ditempuh jika sang wanita tersebut ingin memiliki anak yaitu adopsi atau mencari sel telur dari orang lain. Sangat sulit bagi wanita tersebut untuk mewariskan material genetiknya tanpa harus mewariskan penyakit mitokondria ini (CRG, 2015). Berdasarkan fenomena inilah para peneliti mengembangkan suatu teknik yang disebut transfer mtDNA atau dikenal juga dengan oocyte manipulation atau transfer sitoplasmik untuk mengatasi masalah penyakit mitokondia. Inti dari teknik ini adalah mencegah transmisi mtDNA mutan untuk diwariskan ke generasi selanjutnya dengan cara manipulasi dengan memanfaatkan sitoplasma sel telur yang mengandung mtDNA yang sehat. Sehingga untuk melahirkan bayi yang sehat dengan menggunakan teknik ini dibutuhkan 3 orang yang berbeda yaitu sel sperma dari sang Ayah, nukleus (inti sel telur) dari Ibu dan sitoplasma sel telur dari pendonor, karena melibatkan tiga orang sehingga bayi yang dihasilkan akan memiliki gen dari tiga orang atau dengan kata lain ‘three-parent baby’ (Taylor & Turnbull, 2005). Hal inilah yang dikembangkan oleh Zhang dan koleganya yang saat ini telah berhasil melahirkan bayi laki-laki dengan menggunakan teknik ini (Reardon, 2016a). Walapun telah berhasil melahirkan bayi dengan teknik ini, namun teknik ini masih mengalami perdebatan pro dan kontra sehingga dibeberapa negara teknik ini masih dilarang karena teknik ini dapat dianalogikan dengan proses pendesainan bayi sebelum lahir yang mana bersinggungan dengan harga diri manusia dan kaitannya dalam merubah ciptaan sang pencipta walaupun dengan tujuan untuk memperoleh bayi yang sehat.
Gambar  : Teknik transfer nukleus dalam mencegah pewarisan mtDNA mutan (Taylor & Turnbull, 2005)
            Jika membahas tentang design bayi, terdapat teknologi yang serupa namun hingga saat ini belum terdapat penerapan secara langsung dalam menciptakan bayi. Teknologi tersebut disebut editing gen yang dikenal sebagai CRISPR. Dengan mengedit gen maka hal tersebut dapat memungkinkan kita untuk memperbaiki gen yang mengalami kerusakan pada embrio sehingga memperbaiki genetik generasi yang akan datang. CRISPR ini telah meluas digunakan dalam hal terapi gen, namun hal ini menjadi kontradiktif dan menimbulkan pertentangan ketika akan digunakan secara langsung pada ‘germ line’ karena akan mengubah seutuhnya manusia dan menyebabkan perubahan pada relung gen (Regalado, 2015; Zhang & Wang, 2016).
            Berdasarkan dua kasus diatas diketahui bahwa rekayasa genetik pada manusia umunya telah lama dilakukan, beberapa diterima dan beberapa ditolak, penolakan umumnya terjadi jika menyangkut manipulasi pada germ line karena hal ini akan mengubah individu secara utuh begitu pula denga gen yang akan diwariskannya nanti. Menurut Samperio (2002), rekayasa genetika manusia haruslah ditinjau dan dianalisis dampak hukum dan etika utamanya dalam penelitian embrio yan mengarah pada penciptaan manusia atau pendesainan manusia karena hal ini menyangkut harga diri dan hak asasi manusia. Manusia berbeda dengan hewan dan tumbuhan sehingga penelitian yang berkaitan dengan manusia haruslah dilihat dari sisi etika dan moral. Oleh karena itu, dalam hal kasus yang masih diperdebatkan seperti dua kasus diatas perlu dilihat dari sisi bioetik dimana fungsi dari bioetik itu sendiri adalah untuk memecahkan konflik moral yang mana dalam bioetik ini nilai transdental manusia disoroti dalam kaitannya dengan sang Pencipta.
               Bioetik ada setelah perang dunia kedua yang berfokus pada isu moral dalam lingkup dunia kesehatan, namun saat ini telah mengalami pengembangan yang sangat luas sehingga dikenal pula adanya neuroetik (etika dalam ilmu neurosains), etika genetika (ethics of genetic) dan masih banyak lagi (Rudnick, 2011). Bioetik pada dasarnya memiliki 4 prinsip dasar yaitu : Beneficience, Non maleficence, Autonomy, dan Justice (Aksoy & Elmali, 2002). Beneficience atau dikenal juga sebagai prinsip kebaikan yang berarti pengambilan tindakan untuk menguntungkan dan memajukan kesejahteraan manusia. Non maleficence atau tidak membahayakan. Justice atau prinsip keadilan yaitu memperlakukan orang sama, tanpa prasangka, pemerataan manfaat dan termasuk menjamin keadilan dalam penelitian utamanya dalam lingkup biomedis. Autonomy (otonomi) adalah kebebasan dan kemampuan untuk bertindak dengan cara yang ditentukan sendiri. Ini merupakan hak orang yang rasional untuk mengungkapkan keputusan pribadi secara independen tanpa gangguan dari luar dan meghormati keputusan tersebut. Dalam etika kesehatan Barat, autonomy menempati tempat sentral (Rich, 2015). Jika menurut deklarasi universal UNESCO tetang bioetik dan hak asasi manusia, terdapat lima belas prinsip bioetik yaitu 1) Harga diri manusia dan hak asasi manusia, 2) Manfaat dan bahaya, 3) Responsibilitas terhadap otonomi individu, 4) Izin atau persetujuan, 5) Seseorang tanpa kapasitas  memberi persetujuan, 6) Peduli terhadap kerentanan manusia dan integritas perseorangan, 7) Privasi dan Kerahasiaan, 8) Persamaan dan keadilan, 9) Tidak diskriminatif dan tidak stigmanisasi, 10) Peduli terhadap keberagaman dan pluralism, 11) Solidaritas dan kooperasi, 12) Responsibilitas social dan kesehatan, 13) Berbagi manfaat, 14) Melindungi generasi yang akan datang, dan 15) Melindungi lingkungan, biosfer, dan biodiversitas (Brown, 2014).

ANALISIS
            Berdasarkan prinsip bioetik yang ada, dalam hal kebermanfaatan baik transfer mtDNA maupun editing gen dilakukan untuk mengatasi penyakit herediter namun disatu sisi banyak hal yang harus dipertimbangkan utamanya dalam hal non maleficence, autonomy, dan justice serta harga diri manusia dan hak asasi manusia itu sendiri. Pada kasus transfer mtDNA beberapa isu yang muncul mengenai penggunaan teknologi yang masih cukup baru dan belum diuji sehingga hal ini berkaitan dengan prinsip non maleficence, walaupun kedepannya nanti teknologi ini akan semakin matang namum isu lain yang muncul adalah mengenai hak asasi dan otonomi bayi yang akan dimodifikasi tersebut, seorang bayi yang belum lahir tentu saja tidak dapat memilih apakah dia dengan senang hati mengikuti project tersebut yang mana identitas bayi yang lahir secara sepihak akan diubah sehingga hal ini juga tersangkut masalah perizinan walaupun dilain pihak mungkin kedua orang tuanya telah menyetujui hal ini.
Satu hal yang perlu digaris bawahi adalah proses transfer mtDNA ini walaupun dapat dikatakan mtDNA hanya terdiri dari beberapa persen dari total genom secara keseluruhan namun tentu saja hal ini dapat membuat perubahan yang drastis dalam genom dari diri anak itu dan dapat dikategorikan dalam pelanggaran terhadap anak. Menurut CRG (2015), kemajuan teknologi ini ditakutkan bukan lagi digunakan unuk tujuan medis akan tetapi mengarah ke rekayasa genetik manusia pada aplikasi eugenetik dimana akan terjadi kecenderungan pemilihan sifat-sifat tertentu seperti intelensi yang tinggi, warna mata dan lain-lain nya yang mana hal ini tentu saja akan mempermainkan ciptaan Tuhan dalam hal ini ‘playing God’. Selain itu karena dalam proses transfer mtDNA melibatkan DNA 3 orang utamanya akan membingungkan hubungan si bayi dengan si pendonor sitoplasma sel telur atau dengan kata lain akan memberikan dampak sosial kepada si bayi tersebut.
Pada teknologi editing gen terdapat juga beberapa isu yang masih bertentangan dengan bioetik. Schultz (2016) berpendapat bahwa teknologi editing gen ini belum cukup aman, dibutuhkan waktu yang cukup lama untuk dapat menggunakan teknologi ini pada tingkatan ‘germ line’, selain itu dalam mengatasi penyakit herditer editing gen bukanlah satu-satunya cara yang bisa dilakukan, ada banyak cara lainnya salah satunya deteksi awal penyakit melalui screening embrio dalam mencegah pewarisan penyakit ini, metode ini merupakan salah satu metode standart yang digunakan dalam proses fertilisasi in vitro.
Jika dibandingkan dengan transfer mtDNA, editing gen lebih ditakuti penerapannya utamanya adanya kemungkinan penggunaan editing gen untuk menciptakan intelegensi buatan. Seorang Filsuf Oxford pada tahun 2014 mengangkat tentang kecedasan buatan dimana kedepannya adanya resiko penggunaan teknologi reproduksi dalam meningkatkan kecerdasan (Regalado, 2015).
Hal semacam ini sering menimbulkan dilema etik karena disatu sisi pengembangannya dilakukan untuk kesejahteraan manusia namun di sisi lain juga berbenturan dengan hak asasi objek yang dijadikan penelitian. Menurut Rich (2015) dalam dilema etik seseorang harus dapat memilih apakah sesuatu itu benar secara etika atau merupakan kebenaran itu sendiri atau seuatu yang benar dengan sesuatu yang tepat. Oleh karena itu diperlukan pemikiran yang kritis dalam menentukan keputusan yang akan diambil. Contohnya pada penggunaan teknologi transfer gen mtDNA adalah sesuatu yang benar dilakukan dalam mengatasi penyakit yang disebabkan mutasi mitokondria namun apakah penggunaan teknologi tersebut telah tepat untuk digunakan masih menyimpan tanda tanya.
Dalam menyikapi dilema etik dan isu-isu moral dan etika, peran bioetik menjadi sangat penting utamanya dalam teknologi rekayasa manusia yang berhubungan dengan ‘germ line’. Bioetik akan berperan dalam membatasi hal-hal yang bisa hal-hal apasaja yang boleh dilakukan dalam hal ini kaitannya dengan menjaga hak asasi individu tersebut sebagai seorang manusia. Agar seuatu hal tetap pada koridornya tentu saja diperlukan suatu regulasi dan bioetik disini berperan dalam meregulasi hal tersebut. Karena bioetik menyangkut masalah penerapan etika dalam ilmu biologis atau medis, yang mana diketahui bahwa tiap wilayah memiliki kultur yang berbeda sehingga etika ditiap tempat menjadi berbeda pula, oleh karena itu penerapan rekayasa genetik contohnya transfer mtDNA diperbolehkan di UK namun tidak di Mexico dan beberapa negara lainnya.
Untuk kedepannya kedua teknologi ini baik editing gen maupun transfer mtDNA masih harus melalui pengkajian mendalam dan pembahasan mengenai isu-isu moral dan etika yang muncul sehingga masih perlu waktu yang sangat lama hingga teknologi ini benar-benar dapat diterima dimasyarakat. Sebagai makhluk beragama tentu saja kita mengetahui bahwa segala sesuatunya diciptakan dengan sempurna oleh sang Pencipta karena itu kemajuan teknologi juga harus diregulasi dengan benar agar tidak melanggar batas-batas yang dapat kita lakukan sebagai manusia.

PENUTUP
            Penerapan bioetik sangat penting utamanya dalam teknologi rekayasa genetika dalam hal ini teknologi transfer gen mtDNA dan editing gn. Dimana bioetik memegang peranan dalam meregulasi hal-hal terkait isu moral dan etik sehingga pengembangan teknologi rekayasa genetika ini tidak bertentangan dengan nilai-nilai moral dan etika yang ada dimasyarakat dan menjaga agar manusia tetap pada koridornya dan tidak melampaui batas.

DAFTAR PUSTAKA
Aksoy, S. and A. Elmali. 2002. The Core Concept of The Four Principle of Bioethics as Found in Islamic Tradition. Med Law. 21:211-224.
Brown, G.R. 2014. What is Bioethics. Law and Ethics in Bio-Medical Engineering. Pollitechnika Lodzka. http://mstrzel.eletel.p.lodz.pl/. Accessed : 12/13/2016
CRG. 2015. Human Genetic Engineering Current Science and Ethical Implications. Council for Responsible Genetic. 1-19.
Reardon, S. 2016a. Three-parent baby claim raises hopes and ethical concerns. Nature news. (28 September 2016). http://www.nature.com
Reardon, S. 2016b. Reports of three parents babies multiply. Nature news. (19 October 2016). http://www.nature.com
Regalado, A. 2015. Engineering the Perfect Baby. Biomedicine. (5 March 2015). https://www.technologyreview.com.
Rich, K.L. 2015. Introduction to Bioethics and Ethical Decision Making. http://samples.jbpub.com/9781284059502/Chapter_2_Sample.pdf. Accessed : 12/13/2016. Pp: 33-69.
Rudnick, A. 2011. Bioethics in the 21st Century. Intech. Croatika.
Samperio, G. 2002. Bioethics in Genetic Engineering. Gac Med Mex. 138(1): 109-119.
Schultz, N.L. 2016. We are this close to Designer Babies. Mother Jones. (8 February 2016). http://www.motherjones.com/
Simmon, D. 2008. Genetic Inequality : Human Genetic Engineering. Nature education. 1(1):173.
Taylor, R.W. and D.M. Turnbull. 2005. Mitochondrial DNA Mutations in Human Disease. Nat Rev Genet. 6(5) : 389-402.
Zhang, X. and S. Wang. 2016. From the First Human Gene-editing of Three-Parent Baby. Life Science. 59(12): 1341-1342.

Perkembangan Bioteknologi Tumbuhan (Kultur haploid mikrospora)

Pengantar :
Umumnya embriogenesis terjadi ketika sel gamet jantan dan betina bertemu membentuk zigot uniselular, demikian pula halnya pada tanaman. Namun saat ini embryogenesis pada tanaman juga dapat dibentuk tanpa melibatkan penyatuan kedua sel gamet tersebut, proses ini salah satunya dikenal sebagai kultur haploid. Istilah kultur haploid ini disebabkan embrio berkembang dari generasi sel gametofit pada tanaman yang hanya membawa separuh dari jumlah kromosom fase hidup sporofit tanaman.  Kultur haploid ini muncul seiring perkembangan ilmu biologi khususnya bidang bioteknologi semakin hari semakin meningkat didorong oleh manfaatnya yang luar biasa dalam perkembangan genetik, pemuliaan tanaman, studi fisiologi tanaman dan embriologi.
Sejak tahun 1970 penelitian yang ekstensif tentang kultur haploid dilakukan. Umumnya kultur haploid dapat dihasilkan dari regenerasi gamet betina atau gamet jantan. Ada dua metode untuk produksi kultur in vitro dari gamet jantan (androgenic haploid) yaitu kultur anther dan kultur polen/mikrospora. Kultur anther merupakan salah satu protocol yang mudah dalam produksi tanaman haploid, spesies yang berbeda ataupun kultivar yang berbeda tidak memerlukan kondisi atau protocol tertentu dengan menggunakan kultur anther ini. Akan tetapi dalam kultur anther kerap ditemui masalah berupa kalus kontaminan pada dinding ather bersama dengan polen selain itu tanaman dari antera seringkali merupakan populasi heterogen serta pada beberapa spesies ditemukan bahwa asynchronous pollen berkembang dari kultur anther. Kendala pada kultur anther ini menyebabkan berkembangnya kultur mikrospora (Mishra & Goswami, 2014). Pada makalah ini akan dibahas tentang kultur haploid utamanya kultur mikrospora mengenai beberapa penelitian terbaru dalam meningkatkan embryogenesis dalam kultur mikrospora diantaranya melalui penambahan reduced ascorbate dan reduced glutathione (Zeng, et al., 2017), histone deacetylase inhibitor (Zhang, et al., 2016) dan penerapan kultur shaking (culture shaking) (Yang, et al., 2013)

Pembahasan :
A.    Efek penambahan reduced ascorbate (ASC) dan reduced gluthatione (GSH) dalam meningkatkan embryogenesis kultur mikrospora (Zeng et al., 2017)
            Kultur mikrospora dan kultur anthera sama-sama dapat dilakukan hanya saja kultur mikrospora lebih sering dilakukan oleh para ahli dikarenanakan kultur mikrospora memiliki kelebihan dibanding kultur anthera. Walaupun unggul dibandingkan kultur anther bukan berarti kultur mikrospora tidak memiliki kendala. Salah satu kendala kultur mikrospora adalah kematian sel saat proses kultur. Dalam penelitiannya Zeng et al., (2017) melihat pengaruh dua antioksidan yaitu reduced ascorbate (ASC) dan reduced glutathione (GSH) dalam meningkatkan embryogenesis pada kultur mikrospora tanaman brokoli (Brassica oleracea L. Var. Italica) utamanya dalam mengatasi banyaknya kematian kultur sel selama produksi double haploid homozygous line pada isolated microspore culture (IMC). Salah satu masalah besar pada kultur mikrospora brokoli adalah embrio yang dihasilkan masih sagat rendah. Alasan utamanya adalah karena banyaknya mikrospora mati pada tahap awal induksi, dan sebagian besar struktur sporophytic berhenti berkembang setelah beberapa kali pembelahan dan kemudian mengalami kematian. Mikrospora ini mati dengan cepat setelah mengalami stress sengatan panas yang berdampak  80-90% sel mati setelah 3 hari dalam kultur. Kekurangan ini terjadi sebagai akibat penyimpangan struktural dan fisiologis yang dianggap berasal dari kondisi kultur yang kurang optimal.
            Usaha peningkatan keberhasilan kultur mikrospora brokoli dilakukan Zeng, et al., (2017) dengan melihat kombinasi konsentrasi penambahan ASC dan GSH ke dalam kutur mikrospora. Tiga hybrid kultivar brokoli digunakan dalam penelitian ini diantaranya ‘B415’, ‘B429’ dan ‘B844’ dan berdasarkan eksperimen dilakukan penambahan ASC atau GSH ke media kultur mikrospora pada konsentrasi spesifik yaitu 1, 5, 10, 20, 50 atau 100 mg/l.  Sebelum diinduksi dengan perlakuan ASC atau GSH, sel diberi perlakuan stress panas pada 32,5 ° C selama 24 jam menunjukkan jumlah kematian sel mencapai sekitar 80% setelah 2 hari. Penambahan 10 mg/l ASC dan 20 mg/l GSH secara signifikan menurunkan kematian mikrospora dan memiliki efek yang kuat terhadap jumlah embrio yang dihasilkan. Efek penambahan ASC atau GSH pada induksi embryogenesis mikrospora dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Efek penambahan ASC dan GSH pada induksi embryogenesis mikrospora brokoli (Zeng et al., 2017)
Penambahan ASC maupun GSH secara signifikan menurunkan angka kematian kultur mikrospora 'B415', 'B429' dan 'B844' sedangkan kontrol dengan tanpa perlakuan penambahan ASC maupun GSH menunjukkan 80% kematian setelah 2 hari perlakuan stress panas. Saat menambahkan 1mgl/1 ASC atau GSH ke dalam 1 /2NLN medium, mikrospora menunjukkan 70%  mortalitas yang jauh lebih rendah pada ketiga jenis genotip/kultur. Peningkatan konsentrasi 5 hingga 10 mg/l menunjukkan hasil yang positif dalam menurunkan kematian sel. Penurunan angka kematian mikrospora secara positif mempengaruhi jumlah mikrospora yang viable dengan persentase tinggi untuk terjadinya pembelahan dan mencapai tahap multiselular (embryogenesis).
Berdasarkan hasil penelitian genotipe 'B415', embrio yang dihasilkan dari kultur mikrospora meningkat sekitar 1,2 kali lipat dan 2,5 kali lipat setelah penambahan 10 mg/l ASC dan 20 mg/l GSH (Gambar 1), selain itu penambahan ASC dan GSH juga berpengaruh positif terhadap tingkat regenerasi tanaman yang masing-masing meningkat sebesar 4,2% dan 9,7%. Semakin tinggi konsentrasi ASC maupun GSH yang ditambahkan menghasilkan tingkatan induksi mikrospora yang lebih tinggi, terutama penambahan GSH pada 10 mg/l secara signifikan meningkatkan embrio yang dihasilkan dari 0 sampai 4,9 pada genotip 'B844'
Gambar 1. Embriogenesis mikrospora genotip ‘B415’ terinduksi ASC dan GSH. a) vacuolated microspore; b, microspore dengan dua nukleus yang sama besar; c, microspore dengan dua nukleus yang tidak sama besar; d, struktur multinukleat (5 inti); e, struktur multinukleat (8 inti); f, multinucleate proembryo; g, struktur kalus dengan 4 sel; h, embryo-like structure. Bars = 5 μm (a–d), 15 μm (e), 50 μm (f–g), 100 μm (h)
(Sumber : Zeng et al., 2017)
Penambahan ASC maupun GSH mengakselerasi pertumbuhan kultur mikrospora hal ini disebabkan karena keduanya merupakan antioksidan yang mempengaruhi lingkungan melalui proses reduksi dan oksidasi. Lingkungan redoks (redox environment) yang merupakan penentu krusial bagi pertumbuhan dan perkembangan sel kultur. Meski ada banyak pasangan redoks yang bekerja secara sinergis, Status glutathione dan askorbat redoks dianggap sebagai kunci pengaturan perkembangan embrio, yang terjadi akibat keseimbangan antara masing-masing bentuk tereduksi (reduced askorbat (ASC) dan glutathione (GSH)) dan bentuk teroksidasi (radikal bebas askorbat, glutathione teroksidasi dan dehidroaskorbat).
            Meskipun penambahan ASC dan GSH pada meningkatkan embryogenesis pada kultur mikrospora brokoli, namun penambahannya hingga dosis tertentu dapat menurunkan jumlah embrio. Penambahan 50 mg/l GSH mengurangi jumlah embrio dari mikrospora dibandingkan dengan kontrol, dan diperoleh lebih sedikit embrio yang dapat bertahan setelah transfer. Struktur multiseluler masih dapat berkembang hingga penambahan 100mg/l namun gagal membentuk struktur mirip embrio hal ini menunjukkan bahwa penambahan GSH dalam konsentrasi tinggi memberikan efek terhadap perkembangan embrio dari kultur mikrospora. Sehingga diketahui bahwa penambahan ASC maupun GSH dalam konsentrasi tertentu dapat meningkatkan embryogenesis pada kultur mikrospora namun konsentrasi dan keseimbangan dalam penambahan keduanya harus diperhatikan (Zeng et al., 2017).

A.    Efek histone deacetylase inhibitors pada embryogenesis mikrospora (Zhang, et al., 2016)
            Embriogenesis mikrospora dipengaruhi oleh banyak faktor seperti genotip tanaman donor dan status pertumbuhan, kekuatan mikrospora, kondisi kultur, pretreatment, dan media kultur. Perlakuan stres telah sering digunakan untuk menginduksi embriogenesis, dan merupakan treatmen yang paling sering digunakan dalam embryogenesis microspore yang efisien saat ini, salah satunya adalah penerapan kejutan panas singkat, pretreatment dingin, dan starvasi karbon. Namun saat ini penambahan zat kimia juga telah dilakukan untuk menginduksi embryogenesis pada kultur mikrospora.
            Zhang et al., (2016) melakukan penelitian untuk mengetahui efek histone deacetylase inhibitors pada embryogenesis microspore pada tanaman Pakchoi (Brassicarapa ssp. chinensis L.). Tanaman Pakchoi dikenal juga sebagai Chinese cabbage atau sawi putih. Tanaman yang digunakan sebagai donor mikrospora adalah tanaman F2 dengan 3 genotip yang berbeda yaitu 421, 424, dan 426 dengan perlakuan penambahan histone deacetylase inhibitors trichostatin A (TSA), suberoylanilide hydrox-amic acid (SAHA), dan sodium butyrate (NaB) ke dalam medium NLN-13 untuk meningkatkan embriognesis mikrospora dan regenerasi tanaman Pakchoi  tanpa terbentuknya fase kalus intervensi (intervening callus) (Tabel 2). Ketiga genotip Pakchoi ini memiliki kapabilitas embryogenesis mikrospora yang berbeda, sehingga ketiganya digunakan untuk menunjukkan respon terhadap penambahan histone deacetylase inhibitors, dari hasil penelitian menunjukkan ketiganya memberikan respon yang positif terhadap histone deacetylase inhibitors. Aplikasi TSA secara signifikan meningkatkan jumlah embrio kultur mikrospora, dan frekuensi embriogenesis meningkat sebesar 2,31 - 1,46 - dan 2,48 kali lipat, dibandingkan dengan kontrol masing-masing pada tiga genotip. Konsentrasi optimum TSA untuk genotipe 424 adalah 0,05 μM dalam medium NLN-13, yang menghasilkan hasil embrio terbesar dan frekuensi regenerasi tanaman tertinggi. SAHA memiliki pengaruh yang signifikan terhadap peningkatan laju embrio dan juga dalam mengurangi laju pembentukan kalus. Embrio yang diproduksi dalam medium NLN-13 yang disuplementasi dengan SAHA (0,05 µM dan 0,10 µM), memiliki tingkat regenerasi tanaman tertinggi masing-masing 75,01% dan 87,30% dan konsentrasi optimum NaB dalam medium NLN-13 adalah 2 µM pada tiga genotype untuk menghasilkan induksi embrio tertinggi.
Tabel 2. Efek TSA dan SAHA dalam menginduksi pembentukan embrio dari mikrospora (Zhang et al., 2016)
Berdasarkan peneitian Zhang et al., (2016) menunjukkan bahwa tingkat embriogenesis mikrospora dan regenerasi tanaman dapat ditingkatkan dengan penambahan histone deacetylase inhibitors - TSA, SAHA, dan NaB - di medium NLN-13. Efek TSA pada embryogenesis microspore dapat menyebabkan peningkatan besar dalam proporsi sel yang beralih dari serbuk sari ke pertumbuhan embriogenik. Selain itu terdapat efek yang berbeda pada genotip tanaman yang berbeda dengan jenis histone deacetylase inhibitors yang berbeda pula, hal ini mengindikasikan bahwa respon tiap individu berbeda tergantung dari jenis individu itu sendiri atau jenis perlakuan yang diberikan. Namun secara umum dapat dilihat bahwa penambahan histone deacetylase inhibitors ke media NLN-13 dapat meningkatkan embriogenesis mikrospora dan frekuensi regenerasi tanaman secara langsung, sehingga penambahan histone deacetylase inhibitors dapat digunakan secara rutin untuk kultur mikrospora tanaman Pakchoi.

A.    Efek kultur shaking (culture shaking) pada embryogenesis mikrospora (Yang, et al., 2013).
Embrio kultur mikrospora dalam media cair untuk jangka waktu yang berlebih akan menyebabkan penurunan kekuatan dan browning setelah dipindahkan ke media padat. Dalam beberapa kasus, perlakuan agitasi dan penggantian medium meningkatkan frekuensi embriogenesis dan kualitas embrio. Salah satu usaha peningkatan embryogenesis kultur mikrospora dilakukan oleh mikrospora (Yang, et al., 2013), penelitian ini dilakukan pada tanaman Pakchoi (Brassica rapa ssp. chinensis L.) dengan perlakuan kultur shaking. Kultur shaking yang dimaksud adalah pemberian kocokan atau agitasi pada medium kultur mikrospora. Yang et al., (2013) menggunakan ‘Caiyuan’, ‘Jinpinxiaguan’, ‘Jinxiashi’, ‘Lijiang’ dan ‘Huaguan’ yang merupakan Pakchoi komersial hybrid, serta ‘YS07’ and ‘YS08’ yang merupakan hasil persilangan DH (double haploid) ‘Caiyuan', 'Huaguan' dan 'Lijiang'. Perlakuan kultur shaking bervariasi frekuensinya (0, 40, 50, 80 dan 100 rpm). Efek  kultur shaking terhadap embryogenesis mikrospora dan perkembangan embrio B. rapa dapat dilihat pada tabel 3.
Embrio yang diperoleh setelah 2-3 minggu dari semua varietas yang diuji dalam IMC (isolated microspore cultures)/ kultur mikrospora menunjukkan bahwa kocokan/shaking/getaran dapat meningkatkan frekuensi embriogenesis pada semua varietas yang diuji. Peningkatan frekuensi getaran/shaking (40-100 rpm) efektif dalam meningkatkan embriogenesis dalam 'Huaguan' (Tabel 4), Sedangkan laju pembentukan kotiledon embrio meningkat dalam kondisi shaking pada frekuensi rendah (40 rpm, 50 rpm). Saat frekuensi getar dinaikkan hingga 80 rpm atau 100 rpm, maka pembentukan embrio kotiledon akan mengalami penurunan.
Tabel 3. Efek kultur shaking terhadap embryogenesis mikrospora dan perkembangan embrio B. rapa (Yang, et al., 2013)

Tabel 4. Efek frekuensi getaran yang berbeda terhadap embryogenesis mikrospora dan perkembangan embrio B. rapa (Yang, et al., 2013)
Ketujuh genotipe uji menunjukkan hasil positif dengan perlakuan aerasi melalui perlakuan getaran pada kultur shaking. Frekuensi getaran kultur ideal adalah 40 rpm dan 50 rpm, yang mampu meningkatkan produksi embrio sebesar 11,6-69,37% dan meningkatkan laju kotiledon embrio sebesar 3,14-22,67% dibandingkan embrio yang tidak diaerasi (tidak diperlakukan pada kultur shaking). Selain itu berdasarkan penelitian Selain itu berdasarkan penelitian Yang et al., (2013) menunjukkan bahwa getaran dapat menginduksi  morfogenesis embrio, dan memperpendek waktu kultur antara 1-4 hari. Peningkatan embryogenesis mikrospora pada kultur shaking disebabkan karena perlakuan aerasi mungkin dapat menghilangkan inhibitor, yang terakumulasi di media. Beberapa mikrospora pada kultur utamanya mikrospora yang tua seringkali mengakumulasi inhibitor atau toksik di dalam medium yang menyebabkan mikrospora tersebut tidak dapat berkembang menjadi embrio. Perlakuan aerasi melalui kultur shaking dapat menghilangkan inhibitor atau toksik yang terakumulasi dalam media sehingga terjadi peningkatan embryogenesis pada kultur mikrospora.

Kesimpulan :
Berdasarkan pembahasan dapat disimpulkan bahwa beberapa perlakuan dapat dilakukan dalam usaha peningkatan embryogenesis mikrospora. Beberapa perlakuan tersebut adalah penambahan reduced ascorbate dan reduced glutathione, histone deacetylase inhibitor dan penerapan kultur shaking (culture shaking). Penambahan perlakuan tersebut masing-masing dapat meningkatkan embryogenesis mikrospora namun penambahannya hingga tingkatan tertentu juga dapat menghambat embryogenesis mikrospora sehingga haruslah diperhatikan komposisi yang tepat tiap perlakuan tersebut untuk menunjukkan peningkatan embryogenesis mikrospora yang optimum.

DAFTAR PUSTAKA :
Mishra, V.K. and R. Goswami. 2014. Haploid Production in Higer Plant. IJCBS Review Paper. 1(issue 1): 25-45.
Yang, S., X. Liu, Y. Fu, X. Zhang, Y. Li, Z. Liu, and H. Feng. 2013. The Effect of Culture Shaking on Microspore Embryogenesis and Embryonic Development in Packoi (Brassica rapa L. ssp. chinensis). Scientia Hortculturae. 15(2013): 70-73.
Zeng, A., L. Song, Y. Cui, and J. Yan. 2017. Reduced Ascorbate and Reduced Glutathione Improve Embryogenesis in Broccoli Microspore Culture. South African Journal of Botany. 109(2017): 275-280.
Zhang, L., Y. Zhang, Y. Gao, X. Jiang, M. Zhang, H. Wu, Z. Liu, and H. Feng. 2016. Effect of Histone Deacetylase Inhibitors on Microspore Embryogenesis and Plant Regeneration in Pakchoi (Brassica rapa ssp. chinensis L.). Scientia Hortculturae. 209(2016):61-66.

 
tag