Pages

Monday, July 31, 2017

Perkembangan Bioteknologi Tumbuhan (Kultur haploid mikrospora)

Pengantar :
Umumnya embriogenesis terjadi ketika sel gamet jantan dan betina bertemu membentuk zigot uniselular, demikian pula halnya pada tanaman. Namun saat ini embryogenesis pada tanaman juga dapat dibentuk tanpa melibatkan penyatuan kedua sel gamet tersebut, proses ini salah satunya dikenal sebagai kultur haploid. Istilah kultur haploid ini disebabkan embrio berkembang dari generasi sel gametofit pada tanaman yang hanya membawa separuh dari jumlah kromosom fase hidup sporofit tanaman.  Kultur haploid ini muncul seiring perkembangan ilmu biologi khususnya bidang bioteknologi semakin hari semakin meningkat didorong oleh manfaatnya yang luar biasa dalam perkembangan genetik, pemuliaan tanaman, studi fisiologi tanaman dan embriologi.
Sejak tahun 1970 penelitian yang ekstensif tentang kultur haploid dilakukan. Umumnya kultur haploid dapat dihasilkan dari regenerasi gamet betina atau gamet jantan. Ada dua metode untuk produksi kultur in vitro dari gamet jantan (androgenic haploid) yaitu kultur anther dan kultur polen/mikrospora. Kultur anther merupakan salah satu protocol yang mudah dalam produksi tanaman haploid, spesies yang berbeda ataupun kultivar yang berbeda tidak memerlukan kondisi atau protocol tertentu dengan menggunakan kultur anther ini. Akan tetapi dalam kultur anther kerap ditemui masalah berupa kalus kontaminan pada dinding ather bersama dengan polen selain itu tanaman dari antera seringkali merupakan populasi heterogen serta pada beberapa spesies ditemukan bahwa asynchronous pollen berkembang dari kultur anther. Kendala pada kultur anther ini menyebabkan berkembangnya kultur mikrospora (Mishra & Goswami, 2014). Pada makalah ini akan dibahas tentang kultur haploid utamanya kultur mikrospora mengenai beberapa penelitian terbaru dalam meningkatkan embryogenesis dalam kultur mikrospora diantaranya melalui penambahan reduced ascorbate dan reduced glutathione (Zeng, et al., 2017), histone deacetylase inhibitor (Zhang, et al., 2016) dan penerapan kultur shaking (culture shaking) (Yang, et al., 2013)

Pembahasan :
A.    Efek penambahan reduced ascorbate (ASC) dan reduced gluthatione (GSH) dalam meningkatkan embryogenesis kultur mikrospora (Zeng et al., 2017)
            Kultur mikrospora dan kultur anthera sama-sama dapat dilakukan hanya saja kultur mikrospora lebih sering dilakukan oleh para ahli dikarenanakan kultur mikrospora memiliki kelebihan dibanding kultur anthera. Walaupun unggul dibandingkan kultur anther bukan berarti kultur mikrospora tidak memiliki kendala. Salah satu kendala kultur mikrospora adalah kematian sel saat proses kultur. Dalam penelitiannya Zeng et al., (2017) melihat pengaruh dua antioksidan yaitu reduced ascorbate (ASC) dan reduced glutathione (GSH) dalam meningkatkan embryogenesis pada kultur mikrospora tanaman brokoli (Brassica oleracea L. Var. Italica) utamanya dalam mengatasi banyaknya kematian kultur sel selama produksi double haploid homozygous line pada isolated microspore culture (IMC). Salah satu masalah besar pada kultur mikrospora brokoli adalah embrio yang dihasilkan masih sagat rendah. Alasan utamanya adalah karena banyaknya mikrospora mati pada tahap awal induksi, dan sebagian besar struktur sporophytic berhenti berkembang setelah beberapa kali pembelahan dan kemudian mengalami kematian. Mikrospora ini mati dengan cepat setelah mengalami stress sengatan panas yang berdampak  80-90% sel mati setelah 3 hari dalam kultur. Kekurangan ini terjadi sebagai akibat penyimpangan struktural dan fisiologis yang dianggap berasal dari kondisi kultur yang kurang optimal.
            Usaha peningkatan keberhasilan kultur mikrospora brokoli dilakukan Zeng, et al., (2017) dengan melihat kombinasi konsentrasi penambahan ASC dan GSH ke dalam kutur mikrospora. Tiga hybrid kultivar brokoli digunakan dalam penelitian ini diantaranya ‘B415’, ‘B429’ dan ‘B844’ dan berdasarkan eksperimen dilakukan penambahan ASC atau GSH ke media kultur mikrospora pada konsentrasi spesifik yaitu 1, 5, 10, 20, 50 atau 100 mg/l.  Sebelum diinduksi dengan perlakuan ASC atau GSH, sel diberi perlakuan stress panas pada 32,5 ° C selama 24 jam menunjukkan jumlah kematian sel mencapai sekitar 80% setelah 2 hari. Penambahan 10 mg/l ASC dan 20 mg/l GSH secara signifikan menurunkan kematian mikrospora dan memiliki efek yang kuat terhadap jumlah embrio yang dihasilkan. Efek penambahan ASC atau GSH pada induksi embryogenesis mikrospora dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Efek penambahan ASC dan GSH pada induksi embryogenesis mikrospora brokoli (Zeng et al., 2017)
Penambahan ASC maupun GSH secara signifikan menurunkan angka kematian kultur mikrospora 'B415', 'B429' dan 'B844' sedangkan kontrol dengan tanpa perlakuan penambahan ASC maupun GSH menunjukkan 80% kematian setelah 2 hari perlakuan stress panas. Saat menambahkan 1mgl/1 ASC atau GSH ke dalam 1 /2NLN medium, mikrospora menunjukkan 70%  mortalitas yang jauh lebih rendah pada ketiga jenis genotip/kultur. Peningkatan konsentrasi 5 hingga 10 mg/l menunjukkan hasil yang positif dalam menurunkan kematian sel. Penurunan angka kematian mikrospora secara positif mempengaruhi jumlah mikrospora yang viable dengan persentase tinggi untuk terjadinya pembelahan dan mencapai tahap multiselular (embryogenesis).
Berdasarkan hasil penelitian genotipe 'B415', embrio yang dihasilkan dari kultur mikrospora meningkat sekitar 1,2 kali lipat dan 2,5 kali lipat setelah penambahan 10 mg/l ASC dan 20 mg/l GSH (Gambar 1), selain itu penambahan ASC dan GSH juga berpengaruh positif terhadap tingkat regenerasi tanaman yang masing-masing meningkat sebesar 4,2% dan 9,7%. Semakin tinggi konsentrasi ASC maupun GSH yang ditambahkan menghasilkan tingkatan induksi mikrospora yang lebih tinggi, terutama penambahan GSH pada 10 mg/l secara signifikan meningkatkan embrio yang dihasilkan dari 0 sampai 4,9 pada genotip 'B844'
Gambar 1. Embriogenesis mikrospora genotip ‘B415’ terinduksi ASC dan GSH. a) vacuolated microspore; b, microspore dengan dua nukleus yang sama besar; c, microspore dengan dua nukleus yang tidak sama besar; d, struktur multinukleat (5 inti); e, struktur multinukleat (8 inti); f, multinucleate proembryo; g, struktur kalus dengan 4 sel; h, embryo-like structure. Bars = 5 μm (a–d), 15 μm (e), 50 μm (f–g), 100 μm (h)
(Sumber : Zeng et al., 2017)
Penambahan ASC maupun GSH mengakselerasi pertumbuhan kultur mikrospora hal ini disebabkan karena keduanya merupakan antioksidan yang mempengaruhi lingkungan melalui proses reduksi dan oksidasi. Lingkungan redoks (redox environment) yang merupakan penentu krusial bagi pertumbuhan dan perkembangan sel kultur. Meski ada banyak pasangan redoks yang bekerja secara sinergis, Status glutathione dan askorbat redoks dianggap sebagai kunci pengaturan perkembangan embrio, yang terjadi akibat keseimbangan antara masing-masing bentuk tereduksi (reduced askorbat (ASC) dan glutathione (GSH)) dan bentuk teroksidasi (radikal bebas askorbat, glutathione teroksidasi dan dehidroaskorbat).
            Meskipun penambahan ASC dan GSH pada meningkatkan embryogenesis pada kultur mikrospora brokoli, namun penambahannya hingga dosis tertentu dapat menurunkan jumlah embrio. Penambahan 50 mg/l GSH mengurangi jumlah embrio dari mikrospora dibandingkan dengan kontrol, dan diperoleh lebih sedikit embrio yang dapat bertahan setelah transfer. Struktur multiseluler masih dapat berkembang hingga penambahan 100mg/l namun gagal membentuk struktur mirip embrio hal ini menunjukkan bahwa penambahan GSH dalam konsentrasi tinggi memberikan efek terhadap perkembangan embrio dari kultur mikrospora. Sehingga diketahui bahwa penambahan ASC maupun GSH dalam konsentrasi tertentu dapat meningkatkan embryogenesis pada kultur mikrospora namun konsentrasi dan keseimbangan dalam penambahan keduanya harus diperhatikan (Zeng et al., 2017).

A.    Efek histone deacetylase inhibitors pada embryogenesis mikrospora (Zhang, et al., 2016)
            Embriogenesis mikrospora dipengaruhi oleh banyak faktor seperti genotip tanaman donor dan status pertumbuhan, kekuatan mikrospora, kondisi kultur, pretreatment, dan media kultur. Perlakuan stres telah sering digunakan untuk menginduksi embriogenesis, dan merupakan treatmen yang paling sering digunakan dalam embryogenesis microspore yang efisien saat ini, salah satunya adalah penerapan kejutan panas singkat, pretreatment dingin, dan starvasi karbon. Namun saat ini penambahan zat kimia juga telah dilakukan untuk menginduksi embryogenesis pada kultur mikrospora.
            Zhang et al., (2016) melakukan penelitian untuk mengetahui efek histone deacetylase inhibitors pada embryogenesis microspore pada tanaman Pakchoi (Brassicarapa ssp. chinensis L.). Tanaman Pakchoi dikenal juga sebagai Chinese cabbage atau sawi putih. Tanaman yang digunakan sebagai donor mikrospora adalah tanaman F2 dengan 3 genotip yang berbeda yaitu 421, 424, dan 426 dengan perlakuan penambahan histone deacetylase inhibitors trichostatin A (TSA), suberoylanilide hydrox-amic acid (SAHA), dan sodium butyrate (NaB) ke dalam medium NLN-13 untuk meningkatkan embriognesis mikrospora dan regenerasi tanaman Pakchoi  tanpa terbentuknya fase kalus intervensi (intervening callus) (Tabel 2). Ketiga genotip Pakchoi ini memiliki kapabilitas embryogenesis mikrospora yang berbeda, sehingga ketiganya digunakan untuk menunjukkan respon terhadap penambahan histone deacetylase inhibitors, dari hasil penelitian menunjukkan ketiganya memberikan respon yang positif terhadap histone deacetylase inhibitors. Aplikasi TSA secara signifikan meningkatkan jumlah embrio kultur mikrospora, dan frekuensi embriogenesis meningkat sebesar 2,31 - 1,46 - dan 2,48 kali lipat, dibandingkan dengan kontrol masing-masing pada tiga genotip. Konsentrasi optimum TSA untuk genotipe 424 adalah 0,05 μM dalam medium NLN-13, yang menghasilkan hasil embrio terbesar dan frekuensi regenerasi tanaman tertinggi. SAHA memiliki pengaruh yang signifikan terhadap peningkatan laju embrio dan juga dalam mengurangi laju pembentukan kalus. Embrio yang diproduksi dalam medium NLN-13 yang disuplementasi dengan SAHA (0,05 µM dan 0,10 µM), memiliki tingkat regenerasi tanaman tertinggi masing-masing 75,01% dan 87,30% dan konsentrasi optimum NaB dalam medium NLN-13 adalah 2 µM pada tiga genotype untuk menghasilkan induksi embrio tertinggi.
Tabel 2. Efek TSA dan SAHA dalam menginduksi pembentukan embrio dari mikrospora (Zhang et al., 2016)
Berdasarkan peneitian Zhang et al., (2016) menunjukkan bahwa tingkat embriogenesis mikrospora dan regenerasi tanaman dapat ditingkatkan dengan penambahan histone deacetylase inhibitors - TSA, SAHA, dan NaB - di medium NLN-13. Efek TSA pada embryogenesis microspore dapat menyebabkan peningkatan besar dalam proporsi sel yang beralih dari serbuk sari ke pertumbuhan embriogenik. Selain itu terdapat efek yang berbeda pada genotip tanaman yang berbeda dengan jenis histone deacetylase inhibitors yang berbeda pula, hal ini mengindikasikan bahwa respon tiap individu berbeda tergantung dari jenis individu itu sendiri atau jenis perlakuan yang diberikan. Namun secara umum dapat dilihat bahwa penambahan histone deacetylase inhibitors ke media NLN-13 dapat meningkatkan embriogenesis mikrospora dan frekuensi regenerasi tanaman secara langsung, sehingga penambahan histone deacetylase inhibitors dapat digunakan secara rutin untuk kultur mikrospora tanaman Pakchoi.

A.    Efek kultur shaking (culture shaking) pada embryogenesis mikrospora (Yang, et al., 2013).
Embrio kultur mikrospora dalam media cair untuk jangka waktu yang berlebih akan menyebabkan penurunan kekuatan dan browning setelah dipindahkan ke media padat. Dalam beberapa kasus, perlakuan agitasi dan penggantian medium meningkatkan frekuensi embriogenesis dan kualitas embrio. Salah satu usaha peningkatan embryogenesis kultur mikrospora dilakukan oleh mikrospora (Yang, et al., 2013), penelitian ini dilakukan pada tanaman Pakchoi (Brassica rapa ssp. chinensis L.) dengan perlakuan kultur shaking. Kultur shaking yang dimaksud adalah pemberian kocokan atau agitasi pada medium kultur mikrospora. Yang et al., (2013) menggunakan ‘Caiyuan’, ‘Jinpinxiaguan’, ‘Jinxiashi’, ‘Lijiang’ dan ‘Huaguan’ yang merupakan Pakchoi komersial hybrid, serta ‘YS07’ and ‘YS08’ yang merupakan hasil persilangan DH (double haploid) ‘Caiyuan', 'Huaguan' dan 'Lijiang'. Perlakuan kultur shaking bervariasi frekuensinya (0, 40, 50, 80 dan 100 rpm). Efek  kultur shaking terhadap embryogenesis mikrospora dan perkembangan embrio B. rapa dapat dilihat pada tabel 3.
Embrio yang diperoleh setelah 2-3 minggu dari semua varietas yang diuji dalam IMC (isolated microspore cultures)/ kultur mikrospora menunjukkan bahwa kocokan/shaking/getaran dapat meningkatkan frekuensi embriogenesis pada semua varietas yang diuji. Peningkatan frekuensi getaran/shaking (40-100 rpm) efektif dalam meningkatkan embriogenesis dalam 'Huaguan' (Tabel 4), Sedangkan laju pembentukan kotiledon embrio meningkat dalam kondisi shaking pada frekuensi rendah (40 rpm, 50 rpm). Saat frekuensi getar dinaikkan hingga 80 rpm atau 100 rpm, maka pembentukan embrio kotiledon akan mengalami penurunan.
Tabel 3. Efek kultur shaking terhadap embryogenesis mikrospora dan perkembangan embrio B. rapa (Yang, et al., 2013)

Tabel 4. Efek frekuensi getaran yang berbeda terhadap embryogenesis mikrospora dan perkembangan embrio B. rapa (Yang, et al., 2013)
Ketujuh genotipe uji menunjukkan hasil positif dengan perlakuan aerasi melalui perlakuan getaran pada kultur shaking. Frekuensi getaran kultur ideal adalah 40 rpm dan 50 rpm, yang mampu meningkatkan produksi embrio sebesar 11,6-69,37% dan meningkatkan laju kotiledon embrio sebesar 3,14-22,67% dibandingkan embrio yang tidak diaerasi (tidak diperlakukan pada kultur shaking). Selain itu berdasarkan penelitian Selain itu berdasarkan penelitian Yang et al., (2013) menunjukkan bahwa getaran dapat menginduksi  morfogenesis embrio, dan memperpendek waktu kultur antara 1-4 hari. Peningkatan embryogenesis mikrospora pada kultur shaking disebabkan karena perlakuan aerasi mungkin dapat menghilangkan inhibitor, yang terakumulasi di media. Beberapa mikrospora pada kultur utamanya mikrospora yang tua seringkali mengakumulasi inhibitor atau toksik di dalam medium yang menyebabkan mikrospora tersebut tidak dapat berkembang menjadi embrio. Perlakuan aerasi melalui kultur shaking dapat menghilangkan inhibitor atau toksik yang terakumulasi dalam media sehingga terjadi peningkatan embryogenesis pada kultur mikrospora.

Kesimpulan :
Berdasarkan pembahasan dapat disimpulkan bahwa beberapa perlakuan dapat dilakukan dalam usaha peningkatan embryogenesis mikrospora. Beberapa perlakuan tersebut adalah penambahan reduced ascorbate dan reduced glutathione, histone deacetylase inhibitor dan penerapan kultur shaking (culture shaking). Penambahan perlakuan tersebut masing-masing dapat meningkatkan embryogenesis mikrospora namun penambahannya hingga tingkatan tertentu juga dapat menghambat embryogenesis mikrospora sehingga haruslah diperhatikan komposisi yang tepat tiap perlakuan tersebut untuk menunjukkan peningkatan embryogenesis mikrospora yang optimum.

DAFTAR PUSTAKA :
Mishra, V.K. and R. Goswami. 2014. Haploid Production in Higer Plant. IJCBS Review Paper. 1(issue 1): 25-45.
Yang, S., X. Liu, Y. Fu, X. Zhang, Y. Li, Z. Liu, and H. Feng. 2013. The Effect of Culture Shaking on Microspore Embryogenesis and Embryonic Development in Packoi (Brassica rapa L. ssp. chinensis). Scientia Hortculturae. 15(2013): 70-73.
Zeng, A., L. Song, Y. Cui, and J. Yan. 2017. Reduced Ascorbate and Reduced Glutathione Improve Embryogenesis in Broccoli Microspore Culture. South African Journal of Botany. 109(2017): 275-280.
Zhang, L., Y. Zhang, Y. Gao, X. Jiang, M. Zhang, H. Wu, Z. Liu, and H. Feng. 2016. Effect of Histone Deacetylase Inhibitors on Microspore Embryogenesis and Plant Regeneration in Pakchoi (Brassica rapa ssp. chinensis L.). Scientia Hortculturae. 209(2016):61-66.

 
tag