LAPORAN PRAKTIKUM
BIOKIMIA
PEMISAHAN DAN
IDENTIFIKASI ASAM AMINO
NAMA : RISKY NURHIKMAYANI
NIM : H 411 12 311
KELOMPOK : III (TIGA)
ASISTEN : S. RAHAYU
HARI/TANGGAL : SENIN/11 NOVEMBER 2013
LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2013
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Dewasa ini, ada empat
perkembangan besar yaitu kromatografi pertukaran ion diakhir tahun 1930-an,
kromatografi partisi di tahun 1941, kromatografi gas di tahun 1952 dan
kromatografi filtrasi-gel di tahun 1959. Disamping berbagai kemajuan besar
tersebut, yang memberikan mekanisme tambahan terhadap adsorpsi untuk penyebaran
zat terlarut antara fasa-fasa diam dan bergerak, telah ada juga modifikasi
dalam geometri system kromatografi, seperti dalam kromatografi kertas dan lapis
tipis.
Dengan
berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi pada akhir-akhir ini, maka
penelitian-penelitian di bidangnya masing-masing pun ikut berkembang. Demikian
pula dalam ilmu pengetahuan alam, salah satu terobosan yang telah dilakukan dan
mempunyai peranan penting dalam kehidupan adalah metode identifikasi dan
pemisahan komponen – komponen penyusun dari suatu senyawa dengan menggunakan
teknik kromatografi. Teknik kromatografi adalah suatu teknik pemisahan yang
pada umumnya telah dilakukan bertahun-tahun yang lalu dan telah mengalami
perkembangan yang luar biasa dan merupakan salah satu cara yang paling banyak
dipakai, karena kemampuan dan akurasinya yang tinggi.
Pemisahan asam amino
dengan metode ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut
dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fasa stasioner atau lazim disebut
sebagai fasa diam, dimana bila suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut
dengan volume yang sama dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan
konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut seimbang.
Pada kromatografi lapis
tipis, yang digunakan sebagai fasa stasioner adalah suatu lembaran tipis silika
gel. Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan dua fase
pelarut, dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu
untuk pasangan pelarut tertentu. Perbandingan kecepatan pemindahan komponen
dengan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk mengidentifikasi
komponen-komponen yang dipisahkan. Oleh karena itu melalui percobaan ini akan
dilakukan pemisahan dan identifikasi asam amino dengan menggunakan kromatografi
lapis tipis.
1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan ini
yaitu untuk mengetahui cara pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu
sampel dengan menggunakan metode kromatografi lapis
tipis.
1.2.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukannya
percobaan ini yaitu:
1.
Menghitung nilai Rf dari
asam amino Arginin, histidin, lisin, dan sampel x.
2.
Mengidentifikasi asam amino
dari larutan sampel melalui metode kromatografi lapis tipis.
1.3 Prinsip Percobaan
Pemisahan asam amino secara
kromatografi menggunakan lapis tipis atau plat kromatografi lapis tipis yang
fase gerakannya dengan menggunakan eluen yang terdiri atas campuran n-butanol,
asam asetat dan air. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan jarak noda
yang dihasilkan setelah penyemprotan dengan ninhidrin serta membandingkan nilai
Rf dari asam amino.
1.4. Manfaat Percobaan
Manfaat
dari percobaan ini adalah kita dapat mengetahui dan memahami mengenai pemisahan
asam amino yang baik dengan menggunakan metode kromatografi partisi dimana
metode tersebut sangat berguna bagi kehidupan makhluk hidup misalnya dalam hal
analisis bahan makanan.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Protein yang ditemukan
kadang-kadang berkonjugasi dengan makromolekul atau mikromolekul seperti lipid,
polisakarida dan mungkin fosfat. Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain
nukleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein.
Protein yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan
utama, ialah pertama; protein sederhana, yaitu protein yang apabila
terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino, dan kedua protein terkonjugasi,
yaitu protein yang dalam hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam amino, tetapi
menghasilkan juga komponen organik ataupun komponen anorganik yang disebut
“gugus prosthetic” (Sumarno, dkk.,
2002).
Pada umumnya asam amino diperoleh
sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan
cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan
jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan
pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 1994).
Asam amino adalah sembarang
senyawa organik yang memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH) dan amina
(biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya
terikat pada satu atom karbon (C) yang sama (disebut atom C "alfa"
atau α). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat
basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi
asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi
karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan
senyawa yang paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat
penting dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein. Struktur asam amino adalah sebagai berikut (Poedijaji & Supryanti, 2009 ).
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya
metode gravimetric, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis.
Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan ialah metode
kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi kertas, krometografi
lapis tipis dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 1994).
Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran
berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya.
Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut
serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase
stasioner) dan fase gerak (fase mobile). Fase gerak membawa komponen suatu
campuran melalui fase diam, dan fse diam akan berikatan dengan komponen
tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan
bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut
berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).
Pemisahan asam amino dengan
metode kromatografi ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino terlarut
dalam suatu campuran larutan tertentu pada fase stasioner. Untuk memperoleh
pemisahan asam amino yang baik dapat digunakan dua fase pelarut, misalnya
pasangan fenol- air, n-Butanol- air, atau dengan tiga fase pelarut tersebut
dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi, kertas digunakan
sebagai pendukung air. Campuran komponen yang akan dipisahkan ditempatkan pada
fasa stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fase cair, maka fasse
cair akan melalui fase stasioner sambil
membawa komponen tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen
dengan kecepatan permukaan fasa mobile(cair) merupakan dasar untuk
mengidentifikasikan komponen yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini
disingkat dengan Rf (Rate Of Front) (Tim
Dosen, 2013).
Menurut Akbar (2011), Macam-macam kromatografi :
1. Kromatografi Lapis Tipis yaitu
kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan
lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi
lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan
kromatografi.
2. Kromatografi Penukar Ion merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan.
Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin
sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi
pemisahan rumit dari logam tanah jarangdan asam amino.
3.
Kromatografi
Penyaringan Gel merupakan proses
pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida
linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk
susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan
ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat
dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa
yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.
Pelaksaanan
kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut (Akbar, 2011) :
Kelebihan
penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas
ialah karena dapat dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang
lebig tinggi, dan dapat dilaksanakan denga lebih cepat. Banyak pemisahan yang
memakan waktu berjam-jam bila dikerjakan dengan kromatografi kertas, tetapi
dapat dilaksanakan hanya beberapa menit saja bila dikerjakan dengan TLC (Adnan,
1997).
Kelebihan
dari kromatografi lapis tipis yang lain ialah pemakaian pelarut dan cuplikan
yang jumlahnya sedikit, kemungkinan penotolan cuplikan berganda (saling
membandingkan langsung cuplikan praktis) dan tersedianya beberapa metode
(Gritter, 1991).
Pemurnian
FRY dan reaksinya, hasil ari FAOD diletakkan di RP-18 plat KLT yang terdiri
dari n-butanol, asam asetat dan air (4 : 1 : 5). Pemurnian FRY dideteksi oleh
ninhidrin (noda ungu). Dugaan bahwa FRY terdiri dari gula dan amina termasuk
asam amino. Pada substrat FAOD, valin menunjukkan karakter yang sama pada KLT.
Ketika permunian dalam inkubator dengan FAOD, noda ungu muncul (Akbar, 2011).
Uji
Ninhidrin terjadi apabila ninhidrin dipanaskan bersama asam amino maka akan
terbentuk kompleks berwarna. Asam amino dapat ditentukan secara kuntitatif
dengan jalan menggunakan intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan
konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi ini dilepaskan CO2 dan
NH4 sehingga asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan
mengukur jumlah CO2 dan NH3 yang dilepaskan. Prolin dan
hidroksi prolin menghasilkan warna kompleks yang berbeda warnanya dengan asam
amino lainnya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul
ninhidrin yang bereaksi dengan ammonia yang dilepaskan pada oksidasi asam
amino. Hasil uji positif pada uji ninhidrin diberikan pada asam amino yang
mengandung asam α-amino dan peptida yang memiliki gugus α-amino yang bebas (.
BAB III
METODE PERCOBAAN
3.1 Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah Eluen (n-butanol : asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v,
larutan penyemprot ninhidrin 2%, aseton,
dan larutan asam amino (arginin, glisin, histidin, dan sampel x yaitu campuran
dari arginin, glisin dan alanin).
3.2 Alat
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah
palat kromatografi lapis tipis (KLT), chamber, botol semprot, pipa kapiler, pipet skala, oven,
penggaris, pensil, dan pinset.
3.3 Prosedur kerja
Larutan
eulen disiapkan dengan cara mencampurkan n-butanol, asam asetat, air dengan
perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v yang kemudian dimasukkan ke dalam chamber.
Chamber yang telah diisi dengan larutan eulen kemudian ditutup rapat dengan
plaster bening. Sementara chamber dibiarkan sampai jenuh dengan eulen, kertas
kromatografi disiapkan, digunting sesuai dengan keperluan. Kertas kromatografi
diberi garis dengan menggunakan pensil dengan jarak 1 cm dari atas dan bawah
garis, kemudian pada garis bagian bawah, dibuat titik sebanyak 4. Setelah itu,
kertas kromatografi dimasukkan ke dalam oven.
Kertas
yang telah dipanaskan kemudian diberi totolan larutan asam amino (arginin,
lisin, histidin, dan sampel x). Pentotolan dilakukan dengan menggunakan pipa
kapiler yang dicelupkan ke dalam larutan asam amino kemudian ditandai pada
bagian yang telah diberi titik, setelah itu pipa kapiler tersebut dicuci dengan
menggunakan larutan aseton untuk kemudian digunakan kembali. Setelah semua
titik telah di totol dengan asam amino, kertas kromatografi dimasukkan ke dalam
chamber yang sudah jenuh dengan eulen. Totolan contoh tidak boleh tercelup
dalam eulen. Elusi dihentikan setelah eulen menempuh jarak yang telah
ditentukan sebelumnya dengan menggunakan pensil. Kemudian plat dikeluarkan dan
dikeringkan pada suhu kamar. Setelah itu, dengan hati-hati kertas disemprot
dengan larutan ninhidrin, kemudian kertas dikeringkan dengan dimasukkan ke
dalam oven. Setelah kering akan muncul noda dan pada noda yang timbul diberi
lingkaran pensil lalu diukur jaraknya dengan menggunakan penggaris.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
|
Noda
|
Jarak eluen (cm)
|
Jarak noda (cm)
|
Rf (cm)
|
|
Arginin
|
4,7 cm
|
1 cm
|
0,21 cm
|
|
Glisin
|
4,7 cm
|
0,8 cm
|
0,17 cm
|
|
Histidin
|
4,7 cm
|
1,3 cm
|
0,27 cm
|
|
Sampel X
|
4,7 cm
|
1,8 cm
|
0,38 cm
|
4.1 Reaksi
1. Reaksi Ninhidrin
O
O
ll ll
C OH l OH C
ll NH2
ll
O O
Ninhydrin
Hydrindantin
O O
ll ll
ll
C + C + NH3
O
C OH OH C
ll
ll
O
Ninhydrin Hydrindantin
O O
ll ll
C – N = C + + 3
H2O
C
C
l ll
OH O
Diketohydrindylenedyketohydrindamine
2. Glisin
O
|
C OH
NH2 ||
O
3.
Alanin
O
||
| C OH
NH2 ||
O
4. Arginin
O
||
| C OH
NH2
4.3 Pembahasan
Percobaan
yang dilakukan untuk menghitung nilai Rf dari larutan asam amino dan
mengidentifikasi asam amino dari larutan sampel melalui metode
kromatografi lapis tipis. Identifikasi yang
dilakukan menggunakan teknik kromatografi lapis tipis dengan cara memberi 4
buah totolan larutan asam amino pada kertas kromatografi yang dimasukkan ke
dalam chamber yang jenuh dengan eulen. Eulen dibuat dengan campuran n-butanol :
asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Digunakan larutan eulen karena untuk
memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan dua fasa pelarut,
misalnya pasangan fenol-air, dalam percobaan ini digunakan tiga fasa pelarut
yaitu n-butanol, asam asetat, air, dimana setiap jenis asam amino mempunyai
koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu.
Setelah eulen menempuh jarak yang
telah ditentukan sebelumnya, kertas dikeluarkan lalu dikeringkan dalam suhu
kamar. Selanjutnya disemprotkan dengan ninhidrin dan kemudian dimasukkan ke
dalam oven. Penyemprotan ninhidrin dilakukan karena ninhidrin yang dipanaskan
bersama asam amino maka akan terbentuk kompleks berwarna. Hasil penyemprotan dengan
ninhidrin akan menyebabkan timbulnya warna/noda pada kertas klromatografi. Noda
yang timbul diberi lingkaran unruk diukur Rf nya.
Berdasarkan hasil percobaan diperoleh jarak larutan
dari titik kegaris atas 4,7 cm. Jarak titik ke noda pada arginin sebesar 1 cm,
glisin 0,8 cm, histidin 1,3 cm, dan sampel x 1,8 cm.
Dari pengukuran ini maka akan diperoleh nilai Rf dari
masing-masing asam amino dengan persamaan
Rf
=
Nilai Rf untuk arginin sebesar 0,21 cm, glisin 0,17
cm, histidin 0,27 cm dan sampel x 0,38 cm. Dari nilai Rf yang diperoleh dapat
dilihat bahwa nilai Rf sampel x mendekati nilai Rf hiatidin sehingga dapat
disimpulkan bahwa sampel x mengandung asam amino histidin. Hal
ini membuktikan bahwa pada sampel 4 terjadi pemisahan asam amino yang didasari
oleh asam amino yang terlarut dalam larutan Ninhidrin yang terdistribusi dalam
fasa stasioner yang tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi
zat terlarut didalam kedua pelarut seimbang antara sampel x dengan larutan
ninhidrin.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari percobaan ini adalah nilai Rf untuk arginin sebesar 0,21 cm,
glisin 0,17 cm, histidin 0,27 cm dan sampel x 0,38 cm. Untuk mengidentifikasi asam amino pada plat KLT digunakan
metode kromatografi partisi agar
pemisahan asam amino yang terlarut dalam suatu larutan terdistribusi, dari
hasil yang diperoleh sampel x menunjukkan bahwa dalam sampel x terkandung asam
amino histidin.
5.2 Saran
5.2.1 Saran untuk Laboratorium
Untuk
laboratorium sudah baik baik alat-alat dan
bahan sudah lengkap, Saran untuk laboratorium agar kedepannya fasilitasnya bisa
lebih baik lagi.
5.2.2 Saran untuk Asisten
Untuk asisten biokim sudah cukup
baik, dimana asisten maupun praktikan sama-sama disiplin memakai baju lab di laboratorium,
serta sebelum melakukan praktikum diberikan penjelasan terkait hal yang akan di
percobakan.
DAFTAR PUSTAKA
Adnan, M., 1997, Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan
Makanan, Andi, Yogyakarta.
Akbar, Y., 2011, Pemisahan dan Identifikasi Asam Amino
(online), (http:// akbarbanjar.wordpress.com/2011/03/17/laporan-biokimia/), diakses pada tanggal 15 November
2013 pukul 01.38 WITA.
Alimuddin,
R., 2011, Identifikasi Asam Amino (online), (http://duniaraa 13.blogspot.com), diakses pada tanggal 15 November 2013 pukul 01.40 WITA
Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, Hipokrates,
Jakarta.
Gritter, A., 1991, Biokimia
1, PT. Gramedia, Jakarta.
Poedjiadi A., 1994, Dasar-Dasar
Biokimia, UI Press, Jakarta.
Poedjiadi,
A. dan F. M. T. Supriyanti., 2009. Dasar-dasar
Biokimia. Jakarta, Penerbit
Universitas Indonesia.
Sumarto, S., 2002, Evaluasi Jaminan Sosial Program Lanjut Usia,
P3KS, Jakarta.
Tim Dosen, 2013, Penuntun dan Laporan Praktikum Biokimia,
Universitas Hasanuddin, Makassar.
LEMBAR PENGESAHAN
Makassar, 11 November 2013
Asisten
Praktikan
S. RAHAYU RISKY NURHIKMAYANI
LAMPIRAN I
Bagan Kerja
|
Plat
KLT
|
§ Digunting
dan diberi tanda
§ Dikeringkan
dalam inkubator untuk mengaktifkan
lapisan tipis
§ Ditotolkan
larutan contoh dan sampel
§ Dikeringkan
§ Dimasukkan
ke dalam chamber yang berisi eluen (n-butanol : asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v)
yang telah jenuh.
§ Dielusi
sampai tanda batas yang telah ditentukan
§ Dikeluarkan
dari chember dan dikeringkan
§ Disemprot
dengan larutan ninhidrin 2 %
§ Dikeringkan
dalam inkubator selama beberapa menit
pada suhu 60 oC.
|
Noda
|
-
Ditandai dengan diberi
lingkaran dengan menggunakan pensil
-
Diukur jarak noda dari
tempat penotolan
-
Diukur jarak tempuh
eluen
-
|
Data
|
LAMPIRAN
II
Tabel pengamatan
perhitungan Rf
|
Noda
|
Jarak eluen (cm)
|
Jarak noda (cm)
|
Rf (cm)
|
|
Arginin
|
4,7 cm
|
1 cm
|
0,21 cm
|
|
Glisin
|
4,7 cm
|
0,8 cm
|
0,17 cm
|
|
Histidin
|
4,7 cm
|
1,3 cm
|
0,27 cm
|
|
Sampel X
|
4,7 cm
|
1,8 cm
|
0,38 cm
|
Perhitungan dengan menggunakan rumus
perbandingan kecepatan :
Rf =
1.
Rf =
= 0,21 cm
Jadi,
jarak antara eulen dengan jarak noda sebesar 0,21 cm.
2.
Rf =
= 0,17 cm
Jadi,
jarak antara eulen dengan jarak noda sebesar 0,17 cm
3.
Rf =
= 0,27 cm
jadi,
jarak antara eulen dengan jarak noda sebesar 0,27 cm
4.
Rf =
= 0,38 cm
jadi,
jarak antara eulen dengan jarak noda sebesar 0,38 cm
LAMPIRAN
III
LARUTAN ASAM AMINO YANG DIGUNAKAN
KERTAS KROMATOGRAFI
CHAMBER
HASIL PENTOTOLAN YANG TELAH DI SEMPROT NINHIDRIN
LAMPIRAN IV
Tabel
Rf 20 Asam Amino